CRISPR/Cas9基因編輯技術（包含Base editor）專題研討會

基因編輯技術指能夠讓人類對多個物種內的目標基因進行“精確編輯”，實現對特定DNA片段的刪除、插入、定點突變等。與傳統的TALEN和ZFN基因編輯技術相比，CRISPR/Cas9技術自問世以來，以其操作的便捷性，高效的基因編輯能力獲得青睞，成為當下科研工作者的新寵兒。

目前該技術已廣泛應用于人、大鼠、小鼠、斑馬魚、果蠅、豬、水稻、小麥和擬南芥等動植物（細胞）以及細菌等微生物的基因組靶向改造，并已在功能基因組研究、疾病防治、動植物育種、動物疾病模型開發、基因治療等領域展現出巨大的應用前景。

大量從事醫學和生命科學的研究者，都將會在自身的研究領域中用到CRISPR/Cas9基因編輯技術，但在實際操作中，由于各種原因常常遭遇技術瓶頸，因而無法順利地達成實驗目標。本次研討會將深入系統的講解CRISPR/Cas9基因編輯工具原理，操作流程，理論結合實踐，同時講解實驗操作容易遇到的問題及注意事項、解決方法，將讓大家詳細了解到具體如何利用CRISPR/Cas9技術構建基因修飾動物等。

本次學習班將組建微信群與老師深入交流探討，幫助解決后續實驗過程中遇到的技術及理論問題。可提前準備好自己科研中遇到的問題，通過現場及后續的交流探討，全面掌握CRISPR/Cas9技術應用的方法及技巧，避開科研路上的彎路和陷阱，輕松成為科研達人。

主辦單位：

上海莫速乎教育投資有限公司

上海荊麥信息科技中心

主講專家：

主講專家來自中國科學院，先后參與并承擔973、863、國家自然基金課題及轉基因重大專項課題。研究領域為基因組編輯、體細胞核移植、疾病模型的建立以及胚胎發育過程中表觀遺傳學研究等。有豐富的理論和實際研究經驗。學員通過與專家直接交流，能夠分享到這些頂尖學術機構的研究經驗和實驗設計的思路。學員通過集中專題學習后能夠擴展思路，在研究技術方面領悟更多。

課程目標：

1、 掌握基因打靶與基因編輯技術(ZNF,TALENs,CRISPR/Cas9)，能夠設計sgRNA靶點，構建CRISPR/Cas9質粒，用于基因敲除和敲入。

2、 掌握CRISPR/Cas9質粒轉染方法, 陽性細胞克隆篩選方法體系，基因編輯細胞系的建立，基因修飾情況分析方法。

3、 掌握CRISPR/Cas9脫靶產生的原因，脫靶檢測方法，降低脫靶問題的方法

4、 掌握CRISPR/Cas9的實際應用，對構建基因修飾小鼠和基因修飾大動物（豬）有較深入了解。

5、 掌握新基因編輯工具，如：Cpf1, C2C2, base editing等。

6、 掌握基因編輯研究領域前沿進展，基因編輯工具的拓展應用、臨床應用等，形成利用基因編輯工具結合自己研究內容等科學思維。

課程安排：(具體課程進度根據實際反饋情況進行適當調整)

第一天上午 8:30-11:30

一、基因編輯技術

1、基因打靶技術

2、細胞基因組DNA的修復機制

3、基因敲除與基因敲入

4、ZFNs、TALENs技術

二、CRISPR/Cas9基因組編輯技術原理

1、CRISPR/Cas系統

1.1、CRISPR/Cas系統的發現

1.2、CRISPR/Cas系統的組成

1.3、CRISPR/Cas系統的工作原理

2、CRISPR/Cas9技術的發展及其應用

2.1 CRISPR/Cas9技術的建立

2.2 CRISPR/Cas9技術的應用

2.3 CRISPR/Cas9技術的脫靶問題

第一天下午13:30-17:00

三、CRISPR（sgRNA）的設計與制備

1、目標基因結構及功能的生物信息學分析

2、gRNA的設計（在線互動設計演練）

3、sgRNA模板的制備

4、sgRNA表達載體的構建

4.1 sgRNA的體外表達

4.2 sgRNA在哺乳動物細胞中的表達

5. 以上內容相關實驗的注意事項、實驗技巧、實驗結果講解

四、Cas9的選擇與制備

1、Cas9的選擇

1.1 Cas9蛋白的結構特點簡介

1.2 Cas9的密碼子優化

2、Cas9表達載體的構建

2.1 Cas9的體外表達

2.2 Cas9在脊椎動物細胞中的表達

3、以上內容相關實驗的注意事項、實驗技巧、實驗結果講解

第二天上午8:30-11:30

五、sgRNA活性驗證

1、Indel突變檢測的基本策略

2、基于細胞系活性驗證方法

2.1 PCR產物酶切檢測及利用ImageJ軟件計算活性。

2.2 PCR產物亞克隆測序法

3、基于胚胎的活性驗證方法

4、以上內容相關實驗的注意事項、實驗技巧、實驗結果講解

六、利用CRISPR/Cas9技術創建基因組編輯人及動物細胞系

1、目標基因的基因組組成分析

2、基因組編輯策略設計

2.1基因敲除

2.2基因敲入

2.3定點突變

2.4大片段刪除

3、sgRNA的設計與活性驗證

4、用于基因敲入的供體DNA的設計

4.1 ssODN（單鏈DNA供體）

4.2 雙鏈DNA供體

5、質粒（和/或供體）導入細胞系的方法（脂質體轉染，電轉，病毒轉導）

6、陽性克隆篩選

6.1目標基因組DNA片段的PCR擴增

6.2PCR產物酶切檢測

6.3PCR產物亞克隆測序

7、基因組編輯細胞系的建立

8、提高基因敲入（同源重組）效率的策略

9、以上內容相關實驗的注意事項、實驗技巧、實驗結果講解

第二天下午13:30-17:00

七、利用CRISPR技術創建基因組編輯動物

1、目標基因的組成分析

2、基因組編輯策略的選擇

2.1基因敲除

2.2基因敲入

2.3定點突變

2.4大片段刪除

3、sgRNA的設計與活性驗證

4、用于基因敲入的供體DNA的設計

4.1 ssODN（單鏈DNA供體）

4.2 雙鏈DNA供體

5、通過顯微注射法向受精卵中導入sgRNA/Cas9 mRNA/供體DNA

6、胚胎中基因編輯效率的檢測

6.1單細胞PCR擴增

6.2 PCR產物測序驗證

7、胚胎移植，獲得基因編輯個體

8、基因編輯動物F1代的鑒定

9、通過體細胞克隆法獲得基因編輯動物

9.1供體細胞分離、培養

9.2供體細胞的基因編輯

9.3體細胞核移植操作

9.4胚胎移植

9.5基因編輯個體的鑒定和擴繁

八、基因組編輯技術的脫靶問題

1、脫靶的產生原因

2、脫靶檢測方法

3、如何解決脫靶問題？

4、脫靶問題對不同領域研究者的意義

九、CRISPRi基因表達抑制技術、CRISPRa基因表達激活技術及Base editing單堿基編輯技術

1、dCas9的特征簡介

2、運用CRISPR技術調控基因在細胞中表達的基本實驗過程

3、CRISPR技術介導的轉錄抑制（CRISPRi）

4、CRISPR技術介導的轉錄活化（CRISPRa）

5、單堿基編輯技術

十、基因組編輯技術的前景展望

1、基因組編輯技術對未來社會的革命性影響

1.1 功能基因組研究（功能獲得性研究、功能缺失性研究）

1.2優良經濟性狀動植物新品種的選育

1.3人類疾病的動物模型的建立

1.4 基因治療

2、基因組編輯技術的倫理學問題

十一、CRISPR/Cas9基因編輯技術相關論文撰寫、基金申請技巧、注意事項詳解等

會務信息

時間地點：2019/08/24-25（23日報到）

北京邦泰賓館地址：北京市豐臺區西局西街300號，地鐵9號線七里莊站A2口出

注冊費用：3200元/人? 按交費先后順序安排座次，注冊費包含會場、教材、午餐等費用，不含住宿費。

報名咨詢：王老師? 136 2183 4129 （微信同號）? ?郵箱：msh088@126.com

歡迎索取word函件及報名回執表。

編輯： 會議君